微生物實驗室中的污染：來源、影響與控制策略
在生物實驗室中，污染是一個已經(jīng)明確存在并會造成嚴重后果的問題。污染可分為三大類（物理、化學和生物）。最常見的生物污染是細菌、霉菌、酵母菌、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。本綜述概述了污染物的主要關鍵來源和控制方案。污染的關鍵源頭是在實驗室工作開始到結束期間突然或故意將污染物引入所需的系統(tǒng)。為了克服這一挑戰(zhàn)，日常必須采取多種策略，如從信譽良好的基因庫中獲取純凈、有活力的細胞；定期檢查培養(yǎng)物的特性；采用良好的無菌技術；常規(guī)使用抗生素等?？傊?，本文建議在培養(yǎng)物受到感染的幾天內對其進行目視檢查，從而降低或消除污染的頻率和嚴重程度。
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引言
污染是指在取樣、保存、加工、儲存、轉移、包裝和運輸過程中，將化學、微生物或物理等雜質帶入或帶入起始或中間細胞培養(yǎng)物。細胞培養(yǎng)污染物的定義是培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些元素，由于可能對系統(tǒng)或其使用產(chǎn)生不利影響而不受歡迎。細胞培養(yǎng)物污染是一些微生物實驗室最常遇到的問題，有時會造成非常嚴重的后果?？偟膩碚f，造成污染的原因大多是可避免的程序錯誤和錯誤的技術指導。微生物廣泛分布于環(huán)境中，不受任何限制，甚至在實驗室內的不同地方都有它們的身影。對于使用微生物培養(yǎng)物的研究人員來說，微生物污染是最大的世界性障礙之一。它可能會損失實驗室中有價值的菌株。假陽性培養(yǎng)物是由于常見或不常見的實驗室污染物造成的微生物實驗室報告。由于缺乏適當?shù)墓芾?，微生物實驗室中會出現(xiàn)高濃度的微生物污染物。這是一個全球關注的健康問題，導致難以獲得準確的研究成果。它被人工或系統(tǒng)地引入到我們的培養(yǎng)液中，損害了我們的工作質量。最近，許多文章都提到了這一問題，以前的報告也證明了這一挑戰(zhàn)。最后，為了減少污染物，首先要應用良好的實驗室實踐，其次要遵循適當?shù)恼f明 [2、6、7 和 12]。
污染物正受到高度關注，但對其來源和過程還不甚了解。本研究的主要方法論部分是在觀察性隊列研究和工作區(qū)（實驗室）長年目測調查經(jīng)驗的基礎上進行的。當前研究的目的是確定實驗室內細菌污染的關鍵來源，然后回答交叉污染是如何發(fā)生的？本文旨在介紹防止微生物、物理或化學交叉污染的適當和必要方案，減少假陽性培養(yǎng)報告，并通過實用技術最大限度地提高微生物實驗室的真實結果。
細胞培養(yǎng)污染的類型
2.1 物理污染物
物理污染物是指作為污染物的天然或人工成分。污染物。它也被稱為不需要的異物，如玻璃碎片、金屬、石塊、塑料、不相干的植物物質、毛發(fā)、纖維、移液管、儲存設備、儀器、鋁箔或紙張殘留物以及培養(yǎng)箱中殘留的灰塵顆粒。消毒劑或清潔劑殘留在培養(yǎng)箱中的鋁箔或紙張殘留物和灰塵微粒也屬于此類。
2.2 化學污染
化學污染是指任何非生物物質的存在都會對培養(yǎng)系統(tǒng)造成不良影響。對培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。在任何情況下，它對細胞培養(yǎng)都是無用的，會導致細胞 死亡。它可能會產(chǎn)生毒性。培養(yǎng)基、血清、水中的雜質、金屬離子、內毒素、自由基、洗滌劑和細菌。自由基、洗滌劑、殺菌劑或殺蟲劑殘留物是主要成分。除此之外、二氧化碳培養(yǎng)箱所用氣體中的雜質也包括在內。
2.3. 生物污染
生物污染物是有生命的，可細分為細菌、霉菌、酵母菌、病毒、藻類、原生動物等多個分支、病毒、藻類、原生動物、無脊椎動物等，因此容易受到其他細胞系的交叉污染。交叉污染。微生物物種的污染，可通過物理方式（共用培養(yǎng)基和試劑、使用未拔下的電源插頭等）傳播。共用培養(yǎng)基和試劑、使用未拔下插頭的移液管、處理不當和使用未經(jīng)消毒的試劑、意外溢出或不正常接觸培養(yǎng)基 溢出或與無生命物體的非正常接觸）和生物途徑（直接或間接接觸 手）。任何類型的微生物實驗室對生物污染都很敏感。因此 因此，空氣中的微生物很容易轉移、進入和生長出所需的培養(yǎng)細胞。其背后的原因是存在大量微生物，而且沒有遵循良好的培養(yǎng)規(guī)范。
污染源
| 編號 | 潛在污染源 |
|---|---|
| 1 | - 實地采集的樣本成分和采樣地點。 - 樣本量不足和選擇錯誤。 - 樣本采集和處理設備不當，如塑料或金屬頸管或試管、解剖套件、燒瓶、燒杯、鑷子、移液管、冰盒、玻璃器皿和層流氣流柜。 |
| 2 | - 過多的內部和外部非生物成分（熱、冷、陽光、濕氣）。 - 來自實驗室水槽、空氣、灰塵顆粒、工作臺、地板、桌子、房間、水源和培養(yǎng)箱。 |
| 3 | - 蟲害，尤其是螨蟲。它們會隨氣流移動。由于螨蟲在培養(yǎng)器皿中進進出出，培養(yǎng)物會受到污染。人員可能將昆蟲帶入實驗室（頭發(fā)、衣服、鞋子上）。 |
| 4 | - 使用保質期縮短的培養(yǎng)基。 - 用于制備培養(yǎng)基的試劑、溶液、化學品和水變質。 - 使用不符合驗收規(guī)范的材料。器皿校準不當和設備故障。 - 供應品或資源短缺。 |
| 5 | - 在所有單位引進未經(jīng)授權和不熟練的人員進行樣品的采集、鑒定、定性和保存。 - 未受過教育，沒有足夠的能力執(zhí)行所要求的特定任務。 |
| 6 | - 標本處理過程中產(chǎn)生的氣溶膠或飛濺物和疫情。此外，在運輸和培養(yǎng)過程中也會產(chǎn)生氣溶膠。 |
| 7 | - 由于人手不足，在一批標本中處理過多標本可能導致無法遵守規(guī)程，并可能造成交叉污染的錯誤 |
| 8 | - 污染物進入工作和庫存文化的途徑多種多樣。特別是，由于以下原因，污染物可能會從我們的皮膚和呼吸系統(tǒng)中逸出：人員清潔不足、皮膚消毒不足、手部衛(wèi)生差、實驗室防護服和個人防護設備（如外科手術用一次性手套和外套）不足，所有這些都被不同的研究人員提及。 |
| 9 | - 細胞培養(yǎng)物、鑒定儀器、電子計算機、手機和其他輸入機器的選擇、儲存和處理不當。 - 生產(chǎn)設施薄弱。 - 地板、墻壁和天花板粗糙。 - 缺乏空氣過濾系統(tǒng)。 - 照明和通風不當。 - 通風口、窗臺和排水溝位置不佳。 - 清洗、清潔、廁所和儲物柜設施不足，無法保證操作衛(wèi)生。 |
| 10 | - 使用和處置用于解剖和切割碎玻璃、針頭或刀片的鋒利工具。 - 化學和高溫灼傷或火災。 |
| 11 | - 標簽錯誤、溝通不暢、因工作繁忙而過度勞累。 - 注意力不集中可能是緊張或混亂、糠麩和健康心理障礙。 - 吃東西、喝飲料或使用違禁藥物等不良行為。 |
| 12 | - 二氧化碳培養(yǎng)箱所用氣體中的雜質。 |
| 13 | - 錯誤的研究設計、實驗設置和培養(yǎng)方案。 - 脫離科學依據(jù)的調查和跟蹤。 - 為實驗室試驗花費不必要的時間和精力。 |
污染控制策略
| 編號 | 污染控制策略 |
|---|---|
| 1 | - 遵守設施的書面政策。 - 不要將化學品倒入下水道。 - 應在一天的結束和開始時進行清潔和去污。 |
| 2 | - 采用滅菌方法，如 121°C 高溫高壓滅菌 20 分鐘、160°C 熱風爐 1 小時、微濾或超濾、焚化爐、紫外線、火焰、福爾馬林和乙醇。 - 使用無菌設備和環(huán)境有助于防止給定樣本受到進一步污染。即使是用無菌鋁箔覆蓋的材料也對研究成果的質量起著至關重要的作用。 |
| 3 | - 維護實驗室環(huán)境。首先，暴露在外進行熏蒸。其次，繼續(xù)進行空氣采樣以進行微生物評估。第三，調整實驗室的所有物理因素（實現(xiàn)房間通風系統(tǒng)，在空氣過濾路徑中置換新鮮空氣）；第四，不受人為因素的影響和干擾，最終減少事故發(fā)生的機會。 |
| 4 | - 確保培養(yǎng)基瓶和燒瓶干燥，并用 70% 的酒精或 5% 的次氯酸鈉擦拭，然后才能用于 進一步制備和放入罩中。 - 避免將裝有（培養(yǎng)基、溶液等）的瓶子長時間打開，用完后立即關閉。 |
| 5 | - 正確安裝、包裝和處理儀器 - 檢查項目的驗證日期。 |
| 6 | - 在采集和處理樣品時，應在無菌條件下小心工作。 - 用消毒劑清潔工作區(qū)，準備一個安全無菌的工作區(qū)： · 標本和小袋應逐個處理。 · 樣品去污 · 每次只處理一個細胞系。 |
| 7 | - 減少細胞培養(yǎng)事故發(fā)生的機會，主要可能的解決方案包括：用彩色墨水清晰標注分配任務、書面程序、良好監(jiān)督、分配任務、精心計劃和備份 |
| 8 | - 跟進接種和其他無菌程序。 - 無菌轉移培養(yǎng)物和無菌溶液。 - 制備供研究使用的接種劑和培養(yǎng)物。 - 短期和長期使用庫存培養(yǎng)物，并將其保存在適當?shù)臏囟认?，以及在重新使用前對庫存培養(yǎng)物進行無菌測試。 - 每次只使用一種細胞系，以有效防止交叉感染。 - 不要將飼養(yǎng)培養(yǎng)物長時間放在實驗室工作臺上。 - 必須密封培養(yǎng)容器。如果正在發(fā)生蟲害問題，可使用殺蟲劑、石膏和塑料盒進行防治。通常使用塑料薄膜包裹培養(yǎng)皿。 - 定期對存活細胞進行觀察篩選，并定期檢查細胞系的特征，以確定是否存在污染。所有類型的新細胞在進入實驗室時、細胞解凍前和解凍后都要進行篩查，重要的是要在論文發(fā)表前篩選出不需要的可疑細胞。 - 使用多種技術對混合和受污染的細菌培養(yǎng)物進行額外的亞培養(yǎng)，或丟棄受污染的培養(yǎng)物。 |
| 9 | - 正確的移液技術可確保吸液和分液的體積準確，避免分液時液體飛濺。 - 盡可能將反應和成分蓋上蓋子 |
| 10 | - 使用具有選擇性和保質期的培養(yǎng)基進行制備和后續(xù)工作。 - 切勿將培養(yǎng)基和生物體存放在有光照的冷庫中。 - 在培養(yǎng)基中添加生長抑制物質 |
| 11 | - 氣溶膠會導致樣品間的交叉污染。 - 抗氣溶膠移液器吸頭有一個屏障，當吸頭接觸到潛在的液體污染物時起到密封作用，將其阻隔在屏障內。 |
| 12 | - 對人員進行相關特定目標的凈化規(guī)程培訓。 - 為每節(jié)實驗課提供額外時間，并在實驗室內花大量時間保護自己。 - 始終穿戴個人防護設備。穿全袖大衣，將大衣放在培養(yǎng)室內，并在經(jīng)過至少 30 分鐘的紫外線浴后才穿上。 - 人員和材料的單向工作流程。 |
| 13 | - 保持工作表面和材料整潔有序。 - 避免雜亂無章。 - 盡可能使用小容器 - 活動結束后，將試劑和其他物品放回原處。 - 應定期清理設施。包括地面、天花板和墻壁。 - 定期清空垃圾桶 - 立即清理任何溢出物。溢出物應始終按照正確的處理程序對該區(qū)域進行消毒 - 使用完所有不必要的設備后，將其移走并進行消毒，然后妥善存放 - 在工作之前、期間和之后檢查表面和工具。 - 在日志中記錄每個設備的清潔狀況 |
| 14 | - 在采集、運輸、隔離、鑒定和描述樣本時，始終戴無菌手套。 - 經(jīng)常更換手套，尤其是在對每個樣本進行 DNA 和 RNA 擴增時。 - 基本上，盡量不戴手套處理任何東西。 |
| 15 | - 微生物實驗室的設置是專門為科學實驗而設計的。每個細胞培養(yǎng)都有書面實驗記錄。 |
| 16 | - 使用標準外科口罩，以保護呼吸道口腔飛沫的直接接觸。 - 準備標本時應避免接觸口罩。 - 不要在培養(yǎng)室內交談。如果需要，請使用口罩。您的口腔中有真菌，可能是感染源。 可能是源頭。 |
| 17 | - 在處理細胞時，用適當稀釋的酒精（70%）噴灑雙手，直至手肘。 - 進出實驗室前用消毒肥皂和溫水徹底洗手。從個人手部衛(wèi)生開始控制各類污染，并貫穿培養(yǎng)的所有步驟。 |
| 18 | - 避免在同一培養(yǎng)箱中同時培養(yǎng)動物細胞、人體細胞和微生物細胞。 - 使用推薦的溶液清潔培養(yǎng)箱?？擅刻?、每周或每月清洗一次。 |
| 19 | - 配備房間通風系統(tǒng)，更換空氣過濾通道中的新鮮空氣。 - 空氣過濾和換氣率的設置應確保達到規(guī)定的潔凈室等級。 - 關鍵區(qū)域的氣流應為單向氣流（層流），其速度應足以將微粒從填充 / 關閉區(qū)域掃除。 - 空氣處理管道應進行清潔和適當維護，并應經(jīng)常更換排入培養(yǎng)室空氣的預過濾器。 |
| 20 | - 進入櫥柜時，用 70% 的乙醇擦拭表面。 - 使用前，讓罩內的空氣流通 5 分鐘。這將使任何污染物有望進入層流，而不會最終進入培養(yǎng)基或培養(yǎng)皿。 - 用于進行病毒或細菌培養(yǎng)的儀器不得用于標本制備或裝袋。 - 將封閉的樣本和處理用品放入通風櫥中，在紫外線燈下照射 15 分鐘 - 樣品處理完成后，用 70% 乙醇再次擦拭表面 - 關閉紫外線防護罩，紫外線燈自動開啟 15 分鐘層流氣流罩： 1. 注意 - 不使用時保持箱體完全關閉；始終戴手套；在箱體內至少 6 英寸處工作；頭部遠離箱體； 2. 不要 - 快速移動導致柜內產(chǎn)生大量湍流；在機罩內存放任何物品，因為這些物品可能會阻擋無菌氣流并影響無菌性；對著機罩方向打噴嚏或咳嗽；在打開 UV 和機柜的情況下操作機罩；避免快速進出機罩。 |
污染物對細胞 / 微生物培養(yǎng)及其他的影響
- 爭奪養(yǎng)分，阻礙細胞生長和增殖。
- 使細胞分別接觸到不需要的初級和次級代謝物的利用和產(chǎn)生。
- 從數(shù)量和質量上改變蛋白質、RNA 或 DNA 的合成水平。
- 改變基因表達、細胞信號、形態(tài)和生理機能。
- 在高層次上破壞細胞膜和細胞器。
- 導致突變和染色體變化。
- 破壞自然微生物群落結構和功能。
- 破壞培養(yǎng)物的生長和特性。對抑制細胞新陳代謝產(chǎn)生不利影響。
- 破壞有價值的產(chǎn)品，使培養(yǎng)物失去純度和活力。
- 對技術人員、研究人員、醫(yī)護人員和病人造成多種實驗室感染風險 / 爆發(fā)。免疫缺陷者對嚴重的人類疾病非常敏感。傳播方式的持久性病原體數(shù)量巨大。
- 影響信號轉導。
- 成為公共衛(wèi)生問題，可用于生物武器。
- 造成嚴重的經(jīng)濟挑戰(zhàn)。
- 研究成果質量下降，實驗結果不準確或有錯誤記錄。
- 損失時間、金錢（細胞、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基和血清）和精力（用于培養(yǎng)和建立實驗）已經(jīng)發(fā)生
總之，有三種最佳做法可以保持細胞培養(yǎng)物的完整性和準確性，并促進安全的實驗環(huán)境。首先，使用適當?shù)膶嶒炇以O計。第二，使用正確的培養(yǎng)程序。第三，使用合適的清潔程序。這是成功完成實驗的最佳操作。
污染物的未來發(fā)展方向
實驗室需要有調查審查程序，以確定異常數(shù)量的假陽性培養(yǎng)物，并建立一種機制來 深入確定可能的原因。至少必須每月或每年進行一次隨訪。臨床醫(yī)生、實驗室技術人員和研究人員之間的持續(xù)溝通對于解釋交叉感染和自身感染導致的異常結果仍然至關重要。今后，我們將重點支持三項活動。即：(I). 通過各種公認的科學方法（如代謝和遺傳指紋圖譜）鑒定類群。
(II). 根據(jù)指示微生物的分離和鑒定，確定潛在危害的來源、
(III). 開發(fā)處理微生物危害的方法。當開始探索污染物時，將有望取得進一步的成果，如抗生素生產(chǎn)、醫(yī)療價值、生物技術研究和抗菌活性的耐藥性和敏感性檢測。未來，通過持續(xù)的研究產(chǎn)生全面的科學知識非常重要，甚至可以在微生物多樣性（群落、功能和結構）模式領域進行調查。我們將在該領域開展更多的系統(tǒng)研究，以消除令人沮喪和破壞性的想法：完成獨特的工作，并獲得合適的有活力的純培養(yǎng)物。其優(yōu)點將大于缺點。
結論
總體而言，本研究報告指出，實驗室設備和環(huán)境是潛在的污染源，其濃度很高。要解決這個問題，必須采用各種方法。如今，定期制定、實施和重新驗證規(guī)程是最可接受和最經(jīng)濟實惠的選擇。建立控制點對所有人都至關重要。從采集樣本到處理樣本，每一步都要考慮到關鍵點，采取適當而謹慎的管理策略，可以大大降低污染負荷。最后，本文得出結論，污染物會造成研究工作的損失，并干擾中心細胞教條的正常安排或功能。因此，本文有助于解決微生物實驗室中污染物的短期和長期影響問題。總之，污染是可以完全消除的，但可以通過引入良好的實驗室操作規(guī)范來降低其發(fā)生頻率和后果的嚴重性。
建議
應經(jīng)常對物理、化學和微生物組合進行季節(jié)性調查和持續(xù)監(jiān)測，以保持培養(yǎng)物的純度。基于實際情況的后續(xù)控制機制應能消除交叉污染的風險。
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