結(jié)核分枝桿菌是全球發(fā)病和死亡的主要原因之一，由于耐多藥菌株的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌正變得越來越令人擔憂。結(jié)核分枝桿菌會污染房間、醫(yī)療設(shè)備和研究實驗室，而且對凈化具有很強的抵抗力。

本研究旨在評估在生物安全三級實驗室中使用過氧化氫干霧（DHP）對房間進行結(jié)核分枝桿菌消毒的效果。生物指示劑（BIs）是預(yù)先滅菌的棉質(zhì)組織，上面含有約107 CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌H37Ra。使用滅菌器設(shè)備為“美卓牌DHP消毒機”，使用7.5%的過氧化氫（舒博牌SP-007殺孢子劑），共進行了三次實驗。結(jié)果顯示，DHP在25分鐘內(nèi)存活細菌的減少超過5 log10，且所有生物指示劑均未出現(xiàn)任何菌落。總的來說，DHP有望成為甲醛的有效而安全的替代品。

DF-10A-杭州美卓生物科技有限公司

美卓生物干霧過氧化氫消毒機DF-10A詳細介紹資料。

結(jié)核分枝桿菌主要通過氣溶膠傳播，因此容易污染醫(yī)療機構(gòu)或?qū)嶒炇业姆块g。此外，這些細菌對消毒和熏蒸過程具有極強的內(nèi)在抵抗力，并擁有有效的氧化應(yīng)激防御機制。它們對消毒劑的抵抗被認為介于其他細菌和芽孢之間，且導(dǎo)致這種高抗性的細胞壁成分尚不清楚，但霉菌醇酸和阿拉伯半乳聚糖似乎都與之有關(guān)。

杭州美卓生物科技有限公司|干霧過氧化氫（DHP）對結(jié)核分枝桿菌的功效，3級生物安全實驗室的例行凈化

美卓DF-10A

化學液體和蒸汽是常用的去污劑。傳統(tǒng)的熏蒸方法包括使用甲醛或環(huán)氧乙烷氣體，但由于其毒性和致癌性，這些方法已經(jīng)被淘汰。2004年6月，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將甲醛列為人類致癌物。法國自2006年9月建議不再將甲醛用于房間凈化，并于2007年1月停止生產(chǎn)。過氧化氫因其對各種微生物的生物效果和安全性而成為甲醛的替代品。

過氧化氫已被推薦用于多種材料的消毒，包括牙科器械和支氣管鏡。過氧化氫蒸汽（VHP）在生物安全柜（BSC）、衛(wèi)生保健設(shè)施、救護車、制藥設(shè)施和實驗室的生物凈化中得到越來越廣泛的應(yīng)用。一些研究重點關(guān)注其在生物安全三級實驗室（BSL3）中對結(jié)核分枝桿菌或其他非結(jié)核分枝桿菌（NTM）的消毒效果。

在這項研究中，使用“美卓牌DHP消毒機”測試了過氧化氫（DHP）干霧，作為BSL3空氣和表面凈化的消毒劑。研究目的是評估DHP擴散對清除實驗室菌株M.tuberculosis H37Ra（一種無毒菌株）的效果。

材料和方法

生物指標（BIs）的準備

根據(jù)法國規(guī)范化協(xié)會的AFNOR 72-281和AFNOR 72-190標準進行檢測，適用于生長緩慢的分枝桿菌。M.tuberculosis H37Ra（ATCC 25177）在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基（Bio-Rad）中進行亞培養(yǎng)。亞培養(yǎng)15天后，使用滅菌蒸餾水制備細菌懸浮液，并將其調(diào)整為1 McFarland標準。每次實驗在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù)，將100μl的懸浮液涂抹在風干的11張預(yù)先滅菌的棉質(zhì)組織（4.5×3厘米）的中央。

BSL3實驗室操作

試驗在80米3的BSL3實驗室中進行，包括兩個二級生物安全柜（Securiplus M5142；Astec Microflow，英國）、冷凍箱和培養(yǎng)箱。實驗共進行了三個周期。每個周期中，將BI從玻璃管中取出，并放置在實驗室的九個位置（A至I）：兩個在運行中的生物安全柜中（前面板打開20厘米；平均流速0.45 m3/s），兩個在不同的培養(yǎng)箱中（一個封閉，一個通風），五個在天花板上（在實驗室中間和角落，一個在DHP儀器后面）（圖1）。BI與儀器的距離各不相同（1至9.5米）。為驗證在BIs上培養(yǎng)和計數(shù)細菌的方法，并確保Mycobacteria細胞在這些處理后仍然存活，我們將兩個BIs用作對照，并在樣品接觸DHP的整個過程中一直保持在BSL3之外。房間內(nèi)的供暖、通風和空調(diào)系統(tǒng)被關(guān)閉，以防止DHP在接觸期間發(fā)生意外擴散或稀釋。在接觸DHP兩小時后，系統(tǒng)恢復(fù)。開始擴散前測量的室溫為20至23°C，相對濕度為45至50%。DHP消毒是通過使用7.5%濃度的過氧化氫消毒液（舒博牌SP-007殺孢子劑）的美卓儀器進行的，整個過程在25分鐘內(nèi)產(chǎn)生了100ppm的H2O2。

BSL3的示意圖，包括每個BI的位置

BIs的培養(yǎng)和計數(shù)

將經(jīng)DHP暴露并在曝氣階段結(jié)束后一夜移出房間的9只BI和未經(jīng)DHP暴露的2只BI（對照組），轉(zhuǎn)移到裝有10毫升滅菌蒸餾水的塑料管中。在3分鐘內(nèi)進行超聲波處理（2 W；頻率20 KHz）（美卓）。對回收的10毫升進行稀釋（10-2）處理，使用滅菌蒸餾水。隨后，用0.45-μm過濾器（密理博公司，馬薩諸塞州貝德福德）過濾每種懸浮液（純的和10-2稀釋的），每種2毫升。過濾器用50毫升滅菌蒸餾水沖洗三次，然后放入添加了OADC（批號5188292；Becton Dickinson，Sparks，MD）的Middlebrook 7H11平板上。所有計數(shù)均按照相同的標準進行。CFU在37°C培養(yǎng)4周后進行計數(shù)。超聲波處理后，將所有BI培養(yǎng)在Middlebrook 7H9肉湯（參考號271310，批號1298006；Becton Dickinson，Sparks，MD）中，以確保該技術(shù)能夠有效收集所有分枝桿菌，并且支架上沒有存活的分枝桿菌殘留。

結(jié)果

表1列出了三次DHP擴散暴露的結(jié)果。在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基上，運行1、2和3的初始懸浮液計數(shù)分別為106、108和107CFU/ml。

樣本、地點運行1運行2運行3

細菌計數(shù)（CFU/毫升）增長細菌計數(shù)（CFU/毫升）增長細菌計數(shù)（CFU/毫升）增長

未暴露對照1 5×105是5×106是5×105是

未暴露的對照組2 5×105是5×106是5×106是

A,運行中的BSC 1 0沒有0沒有0沒有

B，運行中的BSC 2 0沒有0沒有0沒有

C，在VHP機器后面0沒有0沒有0沒有

D，距儀器9.5米0沒有0沒有0沒有

E，出口門上0沒有50沒有0沒有

F，距離儀器5米0沒有0沒有0沒有

G，上述儀器0沒有0沒有0沒有

H，在培養(yǎng)箱中0沒有50沒有0沒有

I，在孵化器中0沒有0沒有0沒有

表1使用DHP后每毫升細菌總數(shù)a

BIs培養(yǎng)和計數(shù)

我們在Lowenstein Jensen培養(yǎng)基上對所有初始懸浮液進行了菌落計數(shù)，以評估應(yīng)用于BIs的M.tuberculosis H37Ra的數(shù)量。我們將這些初始值視為理論初始濃度。在三項檢測中，初始接種物值介于106和108 CFU/ml之間。盡管采取了所有可能的預(yù)防措施，并使用McFarland標準進行測量，但這一差異凸顯出很難獲得均勻的分枝桿菌懸浮液。考慮到超聲波對分枝桿菌細胞分離的效果，以及分枝桿菌細胞在BI上干燥24小時后存活率可能降低，未暴露于DHP的BI所獲得的細菌數(shù)被視為實際濃度。未暴露的BI中的細菌數(shù)量在5×105到5×106 CFU/ml之間（取決于初始接種量）。在所有實驗中，我們觀察到大約1-log10的下降，但在所有情況下，我們從對照組中獲得了至少5×105 CFU/ml，這使我們能夠注意到其他BIs有5-log10的下降。

在第一輪實驗中，觀察到在37°C下暴露于DHP 6周后的樣品比初始接種量減少了超過5個對數(shù)值10（在7H11平板上的過濾器上沒有菌落生長）。在37°C下培養(yǎng)6周后，在7H9肉湯中亞培養(yǎng)的棉花組織沒有生長。這證實了超聲波技術(shù)能有效地將有活力的分枝桿菌從BIs中分離出來，DHP是一種有效的去污工具。

在第二輪實驗中，觀察到了相同的結(jié)果，但有兩個例外。一些Mycobacteria細胞留在了BI E上（生長了一個菌落，相當于50 CFU/ml）。這可以用BI和儀器之間的距離以及兩個元件之間的障礙物數(shù)量來解釋。BI H上也長出了一個菌落，但與最初的懸浮液相比，數(shù)量大大減少（50 CFU/ml對107 CFU/ml）。這令人不安，因為這可能意味著DHP進入了培養(yǎng)箱，從而改變了培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)物。然而，在37°C溫度下培養(yǎng)6周后，在7H9肉湯中亞培養(yǎng)的棉花組織沒有生長。

在第三輪實驗中，暴露于二甲基亞砜的樣品在37°C溫度下培養(yǎng)6周后，其菌落數(shù)下降了5 log10以上，而且沒有一種生物活性成分在移栽培養(yǎng)物中產(chǎn)生菌落。

在三項檢測中，我們發(fā)現(xiàn)比初始接種量減少了5 log10以上。這些結(jié)果表明，DHP在室內(nèi)的擴散是有效的，而且短時間（25分鐘）的暴露足以使BI失活。

結(jié)論

生物凈化所面臨的挑戰(zhàn)是找到一種能夠觸及各處感染性微粒的產(chǎn)品。DHP擴散似乎是甲醛熏蒸的一個很好的替代品，特別是在BSL3級凈化中。根據(jù)AFNOR 72-281和72-190標準，至少要使初始接種體減少5-log10，才能確定去污劑是否有效。對Mycobacteria抗氧化能力的體外研究結(jié)果表明，低濃度的H2O2（10-100ppm）就可以有效殺死細菌。因此，本報告中描述的DHP擴散系統(tǒng)使用7.5%H2O2（舒博牌SP-007殺孢子劑）溶液產(chǎn)生干霧，并將室內(nèi)干霧維持在80-100ppm。

在我們的研究中，我們使用的是美卓干霧消毒設(shè)備，它可以實現(xiàn)DHP。如前所述，結(jié)核桿菌具有很強的污染性，因為它能夠形成氣溶膠，然后在環(huán)境中廣泛彌散到所有物體表面。使用酒精擦拭布和噴霧劑進行人工消毒只能處理容易接觸到的區(qū)域。DHP擴散工藝是一種有用的工具，因為它的干霧中含有H2O2，這些帶電粒子的尺寸非常小（直徑約為10μm），可以作為干氣溶膠在空氣中自由流通。因此，DHP擴散劑適合用于消除BSL3的污染。在本文介紹的研究結(jié)果中，我們在三項獨立的試驗中證明了這一過程對M.tuberculosis H37Ra的高效性，在無需人工干預(yù)的自動模式下，熏蒸周期僅為25分鐘。在這些條件下，DHP擴散法能有效殺死結(jié)核桿菌。

這證明了VHP處理是消除M.tuberculosis H37Rv室內(nèi)污染的有效手段。接觸DHP后，沒有發(fā)現(xiàn)任何表面或材料損壞。我們的研究提出的一個問題是，H2O2霧是否會滲入培養(yǎng)箱。我們的研究有效地表明，所有BI（包括培養(yǎng)箱中的BI）上的CFU都減少了。如果在BSL3中發(fā)生污染事故，所有培養(yǎng)物都無法轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)箱中，而且如果H2O2霧滲透到培養(yǎng)箱中，分枝桿菌細胞可能會發(fā)生變化。為了證實這一觀察結(jié)果，還必須進行更多的實驗。

總之，我們的研究表明，美卓的DHP可有效凈化BSL3中的結(jié)核桿菌。為了避免使用致癌物質(zhì)甲醛，DHP擴散技術(shù)是一種很有前途的房間和研究實驗室（如BSL3）凈化方法。然而，我們只測試了一種M.tuberculosis菌株（H37Ra），它與毒性菌株H37Rv具有相同的特征，包括對抗生素的敏感性。這是我們研究的主要局限性。實際上，在BSL3中可以培養(yǎng)出大量的分枝桿菌菌株，包括耐多藥菌株。一些研究發(fā)現(xiàn)，一些非結(jié)核分枝桿菌對消毒劑的耐藥性強于結(jié)核分枝桿菌。即使對免疫力較高的實驗室工作人員來說，非結(jié)核分枝桿菌的危險性較低，但對其他Mycobacteria或非結(jié)核分枝桿菌（例如，經(jīng)常從臨床標本中分離出的復(fù)合分枝桿菌或膿腫分枝桿菌菌株）進行評估也是很有意義的。